Phát hiện tự kháng thể

Trong huyết thanh

Ở các la-bô xét nghiệm thường quy, người ta thường dùng 4 phương pháp sau đây để phát hiện tự kháng thể lưu động: miễn dịch huỳnh quang (immunoflurescence), ngưng kết hồng cầu (hemagglutination), miễn dịch phóng xạ (hay miễn dịch enzym), và điện di ngược dòng (countercurrent electrophoresis). Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật kém nhậy nhất trong số này, và kết quả phụ thuộc vào khả năng chủ quan của người đọc. Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu có độ nhậy cao hơn nhưng lại mất nhiều thời gian. Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay, RIA) thì đòi hỏi sinh vật phẩm đắt tiền; cần có máy đo tia gamma hoặc beta và trang bị xử lý chất thải cũng là những thứ rất tốn kém. Kỹ thuật miễn dịch enzym (enzym-linked immunosorbent assay, ELISA) tránh được vấn đề tiếp xúc với tia phóng xạ nhưng lại đòi hỏi những dụng cụ rất chuyên biệt. Điện di miễn dịch ngược dòng thì rẻ và dễ làm nhưng tương đối kém nhậy.

Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Đây là kỹ thuật thường được dùng để phát hiện nhiều loại tự kháng thể trong huyết thanh. Người ta thường dùng mô động vật để làm cơ chất nếu kháng nguyên hiện diện chung trên cả mô người lẫn mô động vật. Còn những tự kháng thể chỉ giới hạn ở mô người hoặc thậm chí chỉ ở một dòng tế bào người thì chúng ta sẽ không dùng mô động vật được. Vật phẩm mô dùng cho xét nghiệm này được cho đông lạnh ngay sau khi lấy khỏi cơ thể con vật và khi dùng thì đưa máy cắt lạnh và cắt ở -200C.

Huyết thanh bệnh nhân được ủ với cơ chất (mô) trong 30 phút. Sau đó, những kháng thể không gắn vào mô sẽ được rửa sạch trước khi cho kháng thể cấp 2, có gắn chất đánh dấu (thường là huỳnh quang). Kháng thể đánh dấu sẽ liên kết với immunoglobutin của huyết thanh bệnh nhân đã gắn vào kháng nguyên trên cơ chất. Những vị trí có cố định kháng thể sẽ nhìn thấy được dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Mỗi tự kháng thể sẽ được xác định bằng một kiểu bắt màu huỳnh quang đặc biệt trên một cơ chất đặc biệt. Sau khi huyết thanh được xác định là dương tính thì nó sẽ được định hiệu giá để xem kháng thể mạnh đến mức nào. Kết quả định lượng được tính bằng tỉ lệ hiệu giá (ví dụ 1/4, 1/8, 1/32,...) hoặc bằng IU (đơn vị quốc tế). Đa số các phòng thí nghiệm đều dùng kháng thể cấp 2 đặc hiệu IgG, do đó mà chỉ phát hiện được các tự kháng thể lớp IgG (tức kháng thể có ý nghĩa lâm sàng); tự kháng thể lớp IgM không quan trọng lắm. Tuy nhiên, kháng thể kháng nhân là một trường hợp ngoại lệ. Kiểu phát quang của kháng thể kháng nhân cũng có ích cho nghiên cứu lâm sàng, nhưng không có tính chẩn đoán. Hiện nay người ta vẫn không khuyến khích việc làm xét nghiệm “sàng lọc” đối với tự kháng thể. Chỉ những xét nghiệm mang lại lợi ích lâm sàng mới được yêu cầu.

Hình. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp.

Việc phân tích kết quả của xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp phụ thuộc vào lớp kháng thể, hiệu giá của chúng, tuổi cũng như giới của bệnh nhân. Người già, nhất là phụ nữ thường có sản xuất tự kháng thể mà không có triệu chứng lâm sàng nào của bệnh tự miễn. Ngược lại, hiệu giá tự kháng thể cao ở người trẻ cho biết rằng một bệnh tiềm ẩn sẽ xuất hiện sau này.

Ngưng kết hồng cầu

Hồng cầu được dùng như một tế bào chỉ thị (indicator) vì chúng có thể “cụm” lại hoặc ngưng kết khi có kháng thể phản ứng chéo với kháng nguyên trên bề mặt của chúng. Kháng nguyên ở đây có thể là kháng nguyên của chính hồng cầu (như kháng nguyên ABO hoặc nhóm máu khác) hoặc kháng nguyên tinh khiết khác được gắn lên bề mặt hồng cầu. Người ta có dùng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu hay không là phụ thuộc vào việc có sẵn kháng nguyên tinh khiết hay không. Phương pháp gắn nhìn chung không quá đơn giản trừ trường hợp của xét nghiệm tìm yếu tố thấp.

Yếu tố thấp (một kháng thể IgM phản ứng với IgG đóng vai trò kháng nguyên) sẽ cho phản ứng với IgG ngưng kết mạnh hơn là với IgG người còn nguyên bản. Do đó mà người ta đã làm cho IgG ngưng kết bằng cách cho chúng phản ứng với một kháng nguyên đã biết của chúng (tức hồng cầu cừu) hoặc bằng nhiệt. Đa số các phòng thí nghiệm dung hạt latex trong xét nghiệm tìm yếu tố thấp thường quy: IgG người được cho ngưng kết bằng nhiệt và gắn lên hạt latex và những hạt này sẽ ngưng kết khi gặp yếu tố thấp. Đây là một xét nghiệm nhanh và rẻ tiền, có thể dùng làm xét nghiệm sàng lọc đối với yếu tố thấp, nhưng nhược điểm của nó là hay cho phản ứng dương tính giả. Huyết thanh dương tính sau đó sẽ cho làm lại với xét nghiệm Waaler-Rose. Trong xét nghiệm này, kháng thể IgG thỏ (có những quyết định kháng nguyên chung với IgG người) được dùng để gắn lên hồng cầu cừu. Một liều dưới ngưng kết của kháng thể này được đem ủ với hồng cầu cừu và những hồng cầu chỉ thị “đã mẫn cảm” này sẽ được dùng để phát hiện yếu tố thấp là chất có khả năng làm ngưng kết những hồng cầu cừu đã mẫn cảm, chứ không làm ngưng kết hồng cầu nguyên bản. Hồng cầu không mẫn cảm được dùng để phát hiện kháng thể tự nhiên đối với hồng cầu cừu. Kết quả của phản ứng Waaler-Rose được tính bằng IU/ml hoặc tính thành tỉ số hiệu giá. Mặc dù có tên là yếu tố thấp nhưng yếu tố này không có tính chẩn đoán đối với bệnh viêm khớp dạng thấp mà chỉ có ích để theo dõi tiên lượng của bệnh.

Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) và miễn dịch enzym (ELISA)

Đây là những phương pháp rất nhậy dùng để phát hiện tự kháng thể với nồng độ thấp. Nhiều kỹ thuật đã được dùng và mỗi kỹ thuật điều có nhược điểm riêng của nó. Các enzym cũng có thể được dùng như các chất đánh dấu thay cho đồng vị phóng xạ trong RIA, và khi đó kỹ thuật được gọi là miễn dịch enzym (ELISA). Kỹ thuật này có vẻ nhạy hơn RIA.

Một khi chúng ta nghi ngờ bệnh nhân bị mắc SLE thì cần phải tìm kháng thể chống DNA chuỗi kép. Có thể phát hiện kháng thể này bằng nhiều cách; những cách phổ biến nhất là dùng 14C-DNA, 125I-DNA hoặc DNA đánh dấu phóng xạ trước đó bằng cách cho 14C-thymidine vào môi trường cấy để vi khuẩn tiêu thụ. Phương pháp này nhậy cho đến nỗi nhờ nó mà ta có thể phát hiện được mức liên kết DNA rất thấp trong những bệnh nhân khác ngoài SLE. Dùng 125I-DNA có thể thưc hiện một thử nghiệm khác ít nhạy hơn, nhưng kết quả dương tính thì thường nói lên khả năng chỉ SLE hoặc viêm gan mạn hoạt động. DNA chuỗi kép dần dần tách ra thành DNA chuỗi đơn, do đó điều quan trọng là phải quan sát trị số liên kết chứng cho mỗi mẻ để biết mức độ tách ra của kháng nguyên là bao nhiêu. Người ta còn dùng một xét nghiệm khác là miễn dịch huỳnh quang trên ký sinh trùng Crithidia luciliae để tìm kháng thể kháng DNA chuỗi kép; kỹ thuật này cho độ đặc hiệu rất cao, nhưng lại tương đối kém nhậy vì không phải tất cả huyết thanh SLE đề phản ứng được trong xét nghiệm này. Gần đây, Tổ chức Y tế Thế giới đã cho công bố tiêu chuẩn thế giới về kháng thể kháng DNA chuỗi kép.

Một chất lấy từ nọc rắn có tên là α-bungarotoxin có khả năng cho liên kết rất mạnh với thụ thể của Acetylcholine trong dịch chiết xuất lấy từ cơ vân người. Chất này đã được sử dụng để làm xét nghiệm tìm kháng thể chống thụ thể acetylcholine (AChR). Alpha-bungarotoxin tinh khiết được đánh dấu bằng iod phóng xạ và cho kết hợp với chất chiết xuất từ cơ người. Kháng thể AChR sẽ phản ứng với chất này và có thể làm tủa bằng kháng huyết thanh kháng Ig người. Đây là một xét nghiệm rất nhậy; khoảng 90% bệnh nhân nhược cơ nặng cho kết quả dương tính khi làm xét nghiệm, đồng thời có rất ít trường hợp dương tính giả.

Điện di miễn dịch ngược dòng (countercurrent electro-phoresis)

Phương pháp này có thể được dùng để phát hiện kháng thể đối với nhiều loại kháng nguyên nhân chiết xuất được bằng nước muối và kháng nguyên bào tương mà ta gọi chung là “kháng nguyên nhân chiết xuất (ENA). Tuyến ức của bê hoặc thỏ được dùng làm nguồn cung cấp phần lớn kháng nguyên nhân, còn kháng nguyên Ro/SSA là kháng nguyên bào tương và được tách chiết từ lách người. Huyết thanh của mỗi cá thể thường chứa kháng thể chống lại nhiều kháng nguyên; nhưng mỗi tính đặc hiệu kháng thể thường chỉ thấy trên một nhóm nhỏ bệnh nhân mắc bệnh mô liên kết và vì thế mà kháng thể này có tính chẩn đoán đối với bệnh đó (Bảng 12.2).Tuy nhiên, vì kháng nguyên tinh khiết không phải đủ rẻ để có thể xét nghiệm thường xuyên nên người ta đang cố gắng sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất. Riêng huyết thanh chứng có chứa kháng thể đã biết thì hiện đã có bán sẵn.

Bảng. Đọc kết quả về kháng thể chống các thành phần ENA.

RTE = Tinh chất tuyến ức thỏ; HSE = Tinh chất lách người; CTE =Tinh chất tuyến ức bê.

Điện di miễn dịch ngược dòng tức là cho điện di kháng nguyên và kháng thể chạy ngược chiều về phía nhau. Với pH thích hợp, những kháng nguyên hơi có tính axít sẽ di chuyển nhanh chóng về phía anode còn kháng thể thì chạy về phía cathode; trong khi đó, nồng độ của chúng không thay đổi. Nếu huyết thanh bệnh nhân có chứa kháng thể thích hợp một đường tủa sẽ hình thành giữa các lỗ chứa kháng nguyên và kháng thể.

Hình. Điện di miễn dịch ngược dòng.

Điện di miễn dịch ngược dòng thường được dùng tốt nhất là để sàng lọc huyết thanh. Sau đó, tính đặc hiệu kháng nguyên của huyết thanh dương tính được xác định bằng kỹ thuật Ouchterlony (xem Hình 12.10). Chất chiết xuất kháng nguyên được đặt ở lỗ giữa, xung quanh là huyết thanh đã thử thấy dương tính và huyết thanh chứng đã biết tính đặc hiệu. Huyết thanh chứng và huyết thanh thử được đặt cạnh nhau: một đường tủa tương tự sẽ chứng tỏ rằng huyết thanh có tính đặc hiệu kháng nguyên tương tự.

Trong bệnh phẩm sinh thiết

Khảo sát bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (immunohistochemical) trên các mẫu sinh thiết lấy từ mô bình thường và bệnh lý có thể cho thấy có lắng đọng immunoglobulin, bổ thể, và đôi khi có cả kháng nguyên. Immunoglobulin thấy ở đây có thể là kháng thể đến phản ứng với kháng nguyên đặc hiệu mô hay đặc hiệu cơ quan, hoặc có thể là trong phức hợp miễn dịch hình thành từ trước đến lắng đọng ở mô, một số phức hợp có chứa kháng nguyên ngoại sinh.

Các mẫu sinh thiết để dùng cho xét nghiệm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang không được cố định, và phải được chuyển ngay cho phòng thí nghiệm trong nhiệt độ lạnh. Sau đó, chúng sẽ được làm đông lạnh đột ngột và cắt mỏng; các lát cắt được rửa bằng nước muối để giảm độ nhuộm bẩn của nền trước khi cho ủ với kháng huyết thanh có cộng hợp (conjugate) thích hợp. Một mẫu song song được nhuộm với hematoxylin và eosin để xem hình ảnh hình thái học. Kỹ thuật này thường được dùng cho các mẫu sinh thiết thận, da và tủy xương và nó tỏ ra rất có ích cho chẩn đoán. Chỉ định sử dụng kỹ thuật này đã được đề cập ở các chương lâm sàng.