Khảo sát lymphô bào miễn dịch

Có ba kiểu xét nghiệm dùng để đánh giá tế bào:

(1) đếm số lượng các loại tế bào.

(2) thử nghiệm in vivo.

(3) đánh giá chức năng của từng loại tế bào.

Đếm số lượng tế bào lymphô

Chúng ta bắt đầu khảo sát được các tiểu quần thể tế bào lympho từ khi biết rằng chúng có mang các dấu ấn bề mặt khác nhau. Đếm số lượng tế bào lympho trong các tiểu quần thể T và B rất có ý nghĩa đối với các bệnh thiếu hụt miễn dịch và tăng sinh lymphô. Xét nghiệm này ngày càng được áp dụng cho bệnh nhân nhiễm HIV để đánh giá mức độ suy giảm miễn dịch và tiên lượng cũng như để theo dõi các liệu pháp chống virus thực nghiệm. Người ta đã đưa ra một sơ đồ đảm bảo chất lượng để chuẩn hóa dần xét nghiệm này.

Tất cả mọi đánh giá đối với tế bào lympho đều phải tiến hành với máu chống đông mới lấy và chỉ sau khi có ý kiến tham vấn của la-bô miễn dịch.

Trong xét nghiệm này, chúng ta có thể dùng máu toàn phần hoặc tế bào lympho đã tách. Việc tách tế bào lympho từ máu toàn phần được thực hiện bằng cách đặt máu đã chống đông bằng heparin lên chất Ficoll có tỉ trọng thích hợp. Sau khi ly tâm, hồng cầu và bạch cầu múi và chìm vào lớp Ficoll để lại toàn bộ tế bào lympho và một vài monocyte trên bề mặt của lớp Ficoll.

Lớp tế bào này có thể hút ra dễ dàng bằng ống hút và đem rửa sạch để dùng.

Tất cả đã sản xuất kháng thể đơn clôn để nhận diện các tiểu quần thể tế bào lympho T trong máu ngoại biên. Máu toàn phần hay tế bào lympho thuần khiết được ủ với kháng huyết thanh chuột đặc hiệu tương ứng và sau đó đem nhuộm với kháng thể cấp 2 chống Ig chuột đã được đánh dấu. Các tế bào dương tính có thể đếm được dưới kính hiển vi. Một cách khác là người ta cho lympho bào đã nhuộm đi qua một chùm tia laser và các tia sáng phát ra từ các chất đánh dấu trên tế bào sẽ được một cảm biến tiếp nhận. Các tín hiệu điện tử thu được sẽ giúp để phân tích các tiểu quần thể tế bào. Đó là nguyên lý của phương pháp gọi là phép đếm tế bào bằng máy (cytometry). Hiện nay trên thế giới đã có sẵn nhiều kháng huyết thanh đơn clôn dùng để nhận diện và đếm các loại kháng nguyên CD xuất hiện đặc trưng trên các loại tế bào khác nhau như T giúp đỡ/khởi động (CD4), T ức chế/gây độc (CD8). Có điều chúng ta cần lưu ý là khi kết quả được thể hiện bằng tỉ lệ CD4:CD8 thì kết quả này không có ý nghĩa lắm; vì tỉ lệ CD4:CD8 thấp có thể gặp trong hai trường hợp bệnh lý khác nhau xa, đó là suy giảm tế bào giúp đỡ và gia tăng tế bào ức chế. Do đó, kết quả nên được trình bày dưới dạng các con số tuyệt đối dựa vào số lượng lymphô toàn phần.

Hình. Quy trình tách tế bào lymphô ra khỏi máu toàn phần

Lymphô bào B hầu như chủ yếu được nhận diện qua sự hiện diện của immunoglobulin bề mặt là các phân tử được tổng hợp trong các tế bào này. Phương pháp phát hiện là kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp dùng kháng huyết thanh chống immunoglobulin người cộng hợp (conjugate) với chất huỳnh quang (fluorescein). Tế bào lympho được ủ với chất cộng hợp này, sau đó đem rửa và đọc vào kính hiển vi huỳnh quang hoặc máy đếm tế bào. Immunoglobulin bề mặt được nhìn thấy như một vòng nhẫn phát quang xung quanh tế bào. Với phương pháp này, số tế bào lympho B đếm được chiếm 4 - 12% tổng số tế bào lympho trong máu ngoại biên. Ngoài ra, người ta cũng đã bán sẵn các kháng thể đơn clôn khác đặc hiệu tế bào B để chúng ta dùng khi cần.

Phản ứng da quá mẫn muộn ( in vivo)

Có hai loại phản ứng da in vivo được dùng để phát hiện lympho bào T mẫn cảm đặc hiệu, đó là: thử nghiệm nội bì, dùng kháng nguyên tiêm vào lớp nội bì, và thử nghiệm áp: áp kháng nguyên lên da để cho hấp thụ qua da.

Thử nghiệm nội bì đã được nhiều người biết là phản ứng tuberculin (Mantoux). Dẫn xuất protein tinh khiết (PPD) của tuberculin là một chất chiết xuất từ Mycobacterium hominis. Phản ứng dương tính của thử nghiệm da quá mẫn muộn xuất hiện sau 48 giờ: chỗ tiêm đỏ và cứng nhưng không ngứa hay đau. Phản ứng có cường độ tối đa sau 72 giờ và nhạt dần sau nhiều ngày. Hình ảnh này có thể phân biệt dễ dàng với phản ứng Arthus, là phản ứng xuất hiện sau khi tiêm 12 – 24 giờ, có phù và đôi khi ngứa. Trên 75% quần thể người lớn cho kết quả dương tính đối với phản ứng tuberculin. Nếu phản ứng xảy ra mạnh thì có nghĩa là đang có nhiễm trùng mycobacterium hoạt động trong cơ thể và kết quả này rất có ích cho chẩn đoán những trường hợp đang nghi ngờ mắc lao; còn phản ứng âm tính thì nói lên rằng cơ thể trước đây chưa tiếp xúc với vi khuẩn lao hoặc hệ miễn dịch tế bào bị suy giảm, ví dụ như trong trường hợp sarcoidosis hoặc thiếu hụt miễn dịch.

Phản ứng bì cho biết rằng, trước đây bệnh nhân đã được mẫn cảm với kháng nguyên được thử hay chưa (do đó, kháng nguyên thử còn được gọi là kháng nguyên gợi lại). Để tránh khả năng phản ứng âm tính do chưa tiếp xúc, khi xét nghiệm tình trạng suy giảm miễn dịch người ta dùng một panel kháng nguyên thường gặp để thử. Panel này thường bao gồm PPD, Candida albicans, streptokinase-streptodornase, quai bị và trichophyton; hơn 95% người lớn bình thường đáp ứng với ít nhất là một trong những kháng nguyên này. Riêng đối với trẻ em thì có thể chúng chưa tiếp xúc với các kháng nguyên nói trên trong môi trường. Bởi vì chứng thiều hụt tế bào T tiên phát thường thể hiện vào tuổi trẻ em nên chúng ta có thể dùng thêm thử nghiệm DNCB (dinitro-choloro-benzene) để đánh giá. Bệnh nhân được cho mẫn cảm với DNCB bằng cách bôi lên da và 10 ngày sau thì cho thử thách lại với DNCB được hòa loãng nhiều lần. Với người bình thường thì phản ứng dương tính sẽ xuất hiện trong vòng 48 giờ với đỏ và cứng da.

Thử nghiệm áp là thử nghiệm nhất thiết phải dùng đến khi cần xác định kháng nguyên nào là nguyên nhân gây viêm da tiếp xúc. Một số kháng nguyên dễ dàng hấp thụ khi bôi lên da. Một số khác hấp thụ rất kém nên được cho lên giấy cellulose và dán vào da. Sự lựa chọn kháng nguyên phụ thuộc vào tiền sử tiếp xúc, và nhiều bệnh nhân có thể nhạy cảm cùng lúc với nhiều kháng nguyên. Nồng độ kháng nguyên dùng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và không có sản phẩm chuẩn. Thời gian để phản ứng dương tính xuất hiện phụ thuộc vào mức độ hấp thụ và có thể thay đổi từ 2 – 7 ngày. Để cho tiện, người ta thường đọc thử nghiệm áp sau 2 – 4 ngày. Kết quả được gọi là dương tính khi thấy có đỏ da, phù, ngứa, và cứng ở chỗ tiếp xúc kháng nguyên.

Các thử nghiệm chức năng

Các thử nghiệm chức năng in vitro đối với miễn dịch tế bào chỉ nên tiến hành khi các triệu chứng lâm sàng có gợi ý những bất thường của miễn dịch tế bào. Như vậy, có nghĩa rằng, những thử nghiệm này chỉ cần thiết đối với những trường hợp bị thiếu hụt miễn dịch; tuy nhiên chúng cũng có ích trong việc theo dõi điều trị bằng liệu pháp miễn dịch.

Khi tế bào lymphô được cho tiếp xúc với một chất kích thích nào đó, một số ít tế bào lymphô nhỏ sẽ đáp ứng bằng cách chuyển dạng thành các nguyên bào trong thời gian vài ngày. Quá trình này được gọi là chuyển dạng lymphô bào (lymphocyte transformation). Các chất kích thích gồm có ba loại (Bảng 12.4). Đáp ứng tăng sinh sau kích thích có thể đo được bằng kỹ thuật cho thâm nhập thymidine có đánh dấu phóng xạ vào DNA của tế bào lympho. Ức chế di tản bạch cầu (leukocyte migration inhibition, LMI) là một thử nghiệm dễ thực hiện hơn nhưng không được dùng làm xét nghiệm thường quy. Lymphô T sản xuất lymphokin khi được tiếp xúc với kháng nguyên mà chúng đã được mẫn cảm trước đây. Một trong những lymphokin này gây ức chế sự di chuyển của một số tế bào trung tính, chất này được gọi là yếu tố ức chế di tản bạch cầu và có thể định lượng in vitro. Các thử nghiệm chức năng này luôn đòi hỏi phương tiện tốn kém cũng như mất nhiều thời gian (Bảng 12.4). Ngoài ra, khi cần xét nghiệm trên tế bào sống thì mẫu máu đi xét nghiệm phải được chống đông và đưa ngay đến la-bô. Vì có sự khác nhau giữa các lô thí nghiệm cũng như vì chưa có sản phẩm chuẩn mà việc phân tích kết quả trở nên hết sức khó khăn. Tốt nhất nên cùng phân tích với chuyên gia ở phòng thí nghiệm miễn dịch.

Bảng. Các tác nhân gây chuyển dạng lymphô bào T.