Các phương pháp xét nghiệm nấm gây bệnh da liễu (Mycosis diagnosis)

Phương pháp xét nghiệm trực tiếp

Yêu cầu

Xét nghiệm nấm gây bệnh cũng tương tự như xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh. Những bệnh nhân nghi ngờ do nấm gây nên được tiến hành xét nghiệm trực tiếp soi dưới kính hiển vi hoặc được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp để xác định tính chất sinh hoá học từ đó định rõ laòi nấm gây bệnh.

Trong công tác xét nghiệm nấm cần lưu ý điều kiện vệ sinh dụng cụ và không khí xung quanh ở nới làm xét nghiệm , vì trong không khí các bào tử và sợi nấm tạp thường xuất hiện. Nếu không chú ý vệ sinh sạch sẽ dễ lây nhiễm ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

Một số yếu tố có liên quan đến kết quả xét nghiệm.

Bệnh phẩm: trước khi làm xét nghiệm bệnh nhân phải ngừng thuốc điều trị kháng nấm ít nhất 1 - 2 tuần.

Nếu không ngừng thuốc thì nấm tạm thời "bién mất" "thể lặn" làm cho kỹ thuật viên tìm không ra.

Các thuốc mỡ tồn tại trên da khiến trong vi trường có nhiều hạt mỡ khó xem, làm cản trở tầm nhìn của người quan sát.

Các thuốc màu làm cho da bị nhuộm mau, xanh hay tím, đỏ, làm che khuất cấu trúc của vi nấm.

Người quan sát soi phải có định hướng trên cơ sở tóm tắt của lâm sàng.

Xét nghiệm nấm ngoài da soi dưới kính hiển vi

Bệnh phẩm:

Để xét nghiệm trực tiếp nấm ngoài da có thể là tóc, lông,vẩy da đầu, vẩy da mặt, chan, tay, bụng, bẹn, kẽ chân, móng tay…v.v, vẩy da bệnh phẩm được lấy từ các nơi viêm nhiễm nghi có nấm, bệnh phẩm thường được lấy tại phòng xét nghiệm nấm.

Dụng cụ phương tiện:

Dao đầu nhọn, dao trích, kéo, kim, que cấy, phiến kính sạch, lame, gạc, bông cồn 70oC, đèn cồn để đốt. Kính hiển vi.

Dung dịch, hoá chất:

Dung dịch nhuộm gram để xét nghiệm trực tiếp nhuộm nấm hệ thống.

Dung dịch KOH 20% để xét nghiệm nấm da.

Để làm tiêu bản xét nghiệm được trong, giữ tiêu bản được lâu dài phục vụ xét nghiệm và huấn luyện thì dung dịch KOH có thêm glycerin theo công thức sau hoặc dung dịch DMSO.

Dung dịch KOH 20%:

KOH 20 gam; glycerin 20 ml + nước cất vừa đủ 100 ml.

Dung dịch DMSO.

Nước cất 60 ml. KOH 20 gam. Dimetyslfoxide 40 ml.

Phương pháp tiến hành:

Lấy bệnh phẩm: dùng kính lúp có độ phóng đại từ 5-6 lần để quan sát nơi bị viêm nhiễm trên da tổn thương rồi dùng bông cồn 70o sát khuẩn qua để laọi trừ bụi, chất bẩn. Sau dùng dao đã hơ vô trùng trên ngọn đèn cồn, cạo lấy vẩy da hay chất sừng vào phiến kính sạch cũng đã được hơ trên ngọn đèn cồn, lấy bệnh phẩm, nếu là tóc, lông thì dùng kéo để cắt, rồi cắt tóc hoặc lông ngắn độ khoảng 0,1 - 1 cm dồn bệnh phẩm vào giữa phiến kính.

Khi lấy bệnh phẩm xong ta nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch KOH 20% vào giữa bệnh phẩm. Sau đặt lên trên bệnh phẩm 1 lame sạch vô trùng, dùng đầu mũi dao ấn nhẹ xuống lame để dàn đều bệnh phẩm trên lam kính, để nhiệt độ phòng 45 phút rồi soi hoặc hơ phiến kính bệnh phẩm trên ngọn đèn cồn, ta hơ đi hơ lại nhẹ nhàng cho nóng, không sủi bọt rồi để nguội sau đem soi.

Chú ý: khi soi quan sát bệnh phẩm phải đều khắp các vi trường để tìm sợi nấm. Sợi nấm , đoạn sợi nấm hay bào tử đốt có thể bộc lộ trên các đám tế bào sừng của tổ chức da hoặc đứng riêng rẽ tách rời khỏi tế bào da, cần phân biệt sợi nấm với các sợi khác. Sợi nấm thường cong queo, ngoằn ngoèo mềm mại có khi phân nhánh và chiết quang hơn, thành sợi nấm thường dầy trông giống sợi " miến ăn".

Trả lời kết quả:

Soi có sợi nấm, đoạn sợi nấm hoặc có bào tử nấm.

Hoặc: không thấy sợi nấm, đoạn sợi nấm hoặc không thấy có bào tử nấm.

Trường hợp cần xác định loài nấm thì phải nuôi cấy phân lập rồi định danh loài nấm.

Xét nghiệm trực tiếp nấm "hệ thống"

Nấm hệ thống thường là nấm men hay nấm sợi gây bệnh ở trong các tổ chức của cơ thể người, được lấy bệnh phẩm rồi nhuộm gram.

Lấy bệnh phẩm:

Phương tiện để xét nghiệm trực tiếp nấm hệ thống.

Kính hiển vi có vật kính dầu.

Dung dịch nhuộm gram gồm có 4 dung dịch sau:

Dung dịch 1: crystalviolet. Crystalvioet 2%, cồn etylíc 20%, Oxalátamonium 0,8%.

Dung dịch 2: Lugol. Iod 1,3%. KI 2%, Polyvinylpyrrolydon 10%.

Dung dịch 3 :Alcol. Alcohol etylic 95% ....50%, Aceton...50%.

Dung dịch 4: Safranine. Safranine....0, 25%, Alcohol 95...10 %.

Dầu bách hương để soi và xy len để lau tiêu bản.

Thường do các khoa lấy bệnh phẩm trực tiếp từ bệnh nhân gửi đến phòng xét nghiệm nấm trong các dụng cụ tăm bông, ống nghiệm, phương tiện đã vô trùng. Bệnh phẩm có thể là đờm, dịch niêm mạc lưỡi, dịch họng, dịch phế quản, mủ tai, dử mắt, dịch não tuỷ, phân, dịch âm đạo, niệu đạo, máu hoặc ở các nơi viêm nhiễm khác ở các tổ chức trong cơ thể hay ở ngoài da.

Làm tiêu bản:

Dùng que bông hoặc que cấy có bệnh phẩm phết lên lam kính sạch đã hơ vô trùng trên ngọn đèn cồn (để khô cố định ở nhiệt độ phòng). 

Chú ý: phết thành một lớp mỏng đều trên phiến kính với đường kính khoảng 0,5 - 1 cm.

Nhuộm:

Sau khi tiêu bản bệnh phẩm được cố định xong ở nhiệt độ phòng hoặc hơ trên ngọn đèn cồn cố định bằng nhiệt hoặc cồn metilic thì ta tiến hành nhuộm theo phương pháp nhuộm gram như nhuộm vi khuẩn: nhỏ 1 giọt dung dịch số 1 để 1 phút, rửa nước, cho 1 - 2 giọt dung dịch số 2 để 1 phút rồi tráng nước, sau đó nhỏ vài giọt dung dịch 3, tráng tiêu bản bằng nước sạch, tiếp theo nhỏ 1-2 giọt dung dịch số 4 để yên 1 phút. Sau đó tráng tiêu bản cho hết màu đỏ, để khô tiêu bản rồi soi tìm nấm.

Kiểm tra soi tiêu bản bệnh phẩm và đánh giá kết quả:

Tiêu bản nhuộm xong để khô rồi soi dưới vật kính dầu, quan sát trên vi trường nếu thấy mấn men thường bắt mầu tím (gram dương) và có hình dạng là hình cầu, hình ô van, có khi thấy dạng mọc chồi với màu tím đậm. Nếu là sợi nấm thường là các đoạn sợi mềm mại, cong queo, có khi thấy bào tử nấm.

Chú ý : cần phân biệt với các tế bào khác có trong bệnh phẩm.

Trường hợp nghi ngờ thì phải chờ kết quả nuôi cấy. Trong xét nghiệm nấm hệ thống người ta rất lưu ý đến kết quả nuôi cấy vì theo kinh nghiệm cho kết quả cao hơn phương pháp soi trực tiếp. Trong thực tế người ta thường kết hợp 2 phương pháp.

Phương pháp nuôi cấy nấm da gây bệnh

Phương pháp soi trực tiếp nấm từ bệnh phẩm chỉ cho ta biết bệnh phẩm có nấm hay không có nấm, muốn biết nấm đó thuốc loài giống nào thì ta cần phải nuôi cấy trên một số môi trường thích hợp để nấm phát triển thành những khuẩn lạc nấm, rồi dựa vào các đặc điểm đại thể và vi thể để xác định loài. Một số trường hợp phải dựa vào tính chất sinh hoá học của từng loại mới định được loài nấm theo khoá phân loại. Thường người ta lấy bệnh phẩm nghi nhiễm nấm vào một số môi trường như môi trường matala, môi trường sabouraud, môi trường czapex Dox, môi trường huyết tương.

Nuôi cấy nấm da

Người ta thường cấy vào môi trường sabouraud có thành phần pépton 10 gam, glucoza 40 gam, chlorocit 100 mili gam, actidon 500 mg, thạch 20 gam, nước cất vừa đủ 1000 ml. Trong môi trường trên có chlorocit nhằm mục đích ức chế một số vi khuẩn, còn actidion (cyclohexamit) là một kháng sinh có khả năng ức chế một số tạp nấm thường có mặt trong không khí hay lây nhiễm vào bệnh phẩm. Với môi trường trên được ứng dụng để nuôi cấy định loài nấm ngoài da. Bệnh phẩm là các vẩy da được lấy từ bệnh nhân cấy vào môi trường đạt tủ ấm 28o C trong khoảng 10- 14 ngày, nấm có trong bệnh phẩm sẽ phát triển hình thành khuẩn lạc màu sắc khuẩn lạc,thể chát của khuẩn lạc và tiếp tục làm tiêu bản quan sát vi thể dưới kính hiển vi để xác định giống loài nấm. Một số trường hợp phải nuôi cấy tiếp trên môi trường lựa chọn để xem tính chất, đặc điểm sinh hoá học rồi dựa vào khoá phân loại để định loài nấm. Trong việc định loài nấm gây bệnh ngoài da người ta thường dựa vào đặc điểm hình dạng của các cơ quan sinh sản vô tính và hữu tính của nấm.

Nuôi cấy một số loài dạng nấm men

Trong việc xác định một số loài nấm men như các loài candida, người ta thường cấy bệnh phẩm vào môi trường sabouraud, môi trường malata, môi trường huyết tương có thêm kháng sinh, để ở nhiệt độ 28o C, thường sau vài ngày nấm phát triển thành khuẩn lạc, khuẩn lạc dạng nấm men thường giống khuẩn lạc vi khuẩn dạng kem, dựa vào tính chất khuẩn lạc, vài đặc điểm vi thể cùng với tính chất sinh hoá học của tứng loại đồng hoá, lên men các đường khác nhau mà người ta định loại. Trong các loại nấm men candida gây bệnh thì người ta thường thấy loài candida albicans chiếm ưu thế nhiều hơn cả so với các loài candida khác. Gần đây chúng tôi sử dụng môi trường huyết tương đơn giản để nuôi cấy xác định nấm men candida nhanh chóng và tiết kiệm được môi trường hoá chất.

Thành phần môi trường huyết tương.

Huyết tương lấy từ máu người 100 ml bổ xung vào 100 mg clorocit rồi đóng vào ống nghiệm vô trùng , mỗi ống 0,5 ml, được kiểm tra vô trùng về vi khuẩn và nấm . Sau đó cấy bệnh phẩm trực tiếp vào môi trường trên đặt môi trường ở nhiệt độ 37o C sau 24 giờ có thể kiểm tra soi trực tiếp dưới kính hiển vi nếu có nấm candida sẽ xuất hiện tế bào hình trứng, hính cầu và thường có chồi nhỏ dạng hình số tám, một đầu nhỏ (hình con lật đật), loài candida albicans thì có xuất hiện dạng chồi ống giống "mầm giá".

Chẩn đoán nấm gây bệnh bằng phương pháp huyết thanh

Nguyên lý: cũng như vi khuẩn, vi rút trong chẩn đoán một số loài nấm gây bệnh hệ thống người ta cũng ứng dụng phương pháp chẩn đoán huyết thanh. Đặc biệt ở các loài nấm gây bệnh hệ thống trong cơ thể người cũng hình thành các kháng thể mà thông qua huyết thanh có thể phát hiện ra nấm, vì ở các loài nấm này do cấu trúc của kháng nguyên khác nhau nên tạo ra các kháng thể đặc hiệu riêng biệt như các loài nấm candida albicans, aspergillus, histoplasma capsulatum, blastomyces dermatitidiss, còn đối với nấm ngoài da thì ứng dụng phương pháp trên chưa được phổ biến vì tính đặc hiệu của kháng nguyên kém, mặt khác còn phụ thuộc vào khả năng đường thâm nhập của mầm bệnh.

Trong chẩn đoán huyết thanh đối với nấm gây bệnh thường sử dụng phương pháp khuyếch tán trên thạch (diffussion) và phương pháp điện di miễn dịch (Immunoelectrophoressis), hoặc phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA).

Chẩn đoán nấm gây bệnh bằng phương pháp gây bệnh trên động vật

Đây là phương pháp cũng được dùng trong chẩn đoán nấm gây bệnh. Nguyên tắc của phương pháp là dùng động vật khoẻ mạnh làm thực nghiệm như chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ...Những trường hợp bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh nấm cần chẩn đoán xác định, thì người ta lấy một ít bệnh phẩm từ nơi nghi ngờ nhiễm trên cơ thể bệnh nhân, rồi nghiền trong dụng cụ vô trùng với một ít nước muối sinh lý 9 %o vô trùng có chứa kháng sinh tạo thành một hỗn dịch. Sau đó tiêm hỗn dịch vào một trong các cơ quan của động vật như : tinh hoàn, tĩnh mạch, ổ bụng, dưới da v.v... và theo dõi động vật một thời gian, sau đó mổ động vật quan sát các cơ quan tổ chức để kết luận và làm tiêu bản xét nghiệm nấm (giải phẫu bệnh lý, soi trực tiếp, cấy nấm v.v...). Trường hợp bệnh phẩm là vẩy da thì người ta cạo hoặc nhổ lông ở động vật, rồi dùng giấy ráp mịn cọ nhẹ trên đám da, sau đó áp bệnh phẩm vẩy da vào và băng lại theo dõi hàng ngày. Nếu trong bệnh phẩm có nấm da thì sẽ gây bệnh ngoài da ở động vật thực nghiệm.da